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蛋白質聚集因素多種多樣,一文理清聚集途徑及控制策略

藥事縱橫
2116
11個月前

蛋白質




一、蛋白質聚集,企業不可忽視的問題



當前蛋白及多肽類藥物研究的如火如荼,而蛋白質聚集是所有研發企業所面臨的一個關鍵性難題。如若在整個生產工藝過程中蛋白質發生聚集,那么首先影響的是蛋白質的收率,更重要的是蛋白質聚集還會對蛋白質質量產生較大的影響,進而影響蛋白質的藥效。因此了解蛋白質聚集的途徑、影響因素和控制蛋白質聚集是十分必要的。

而蛋白質的聚集因素多種多樣,如上游工藝以及下游工藝的影響,以及儲存以及運輸條件的影響等等??梢哉f稍不注意,蛋白質就會發生聚集。今天筆者就借用本篇文章來談談蛋白質聚集途徑以及防控手段。


二、上游工藝的影響



(1)pH

pH是上游工藝中調節細胞生長和代謝物產生的關鍵參數之一。pH值會影響蛋白的穩定性。通常pH在等電點附近發生顯著變化的話,特別是pH向等電點變化,會導致蛋白質部分去折疊,從而發生聚集。

(2)離子

在上游工藝中,我們會使用到一些培養基,涉及到如Cl-、SO42-、PO43-、NO3-、Na+、K+、Ca2+等。而這些陰離子和陽離子都會影響蛋白質的聚集。離子結合后蛋白質的構象發生變化,從而影響蛋白質的聚集。離子與蛋白質的結合本質上可以是放熱的或吸熱的。離子與放熱位點的發結合可以穩定構象,進而抑制蛋白聚集。而離子與蛋白質的吸熱結合破壞了穩定的結構,進而加速了蛋白的聚集。因此,了解離子與蛋白質的結合行為并通過調節離子類型或濃度,可以控制蛋白質的聚集行為。

(3)剪切/攪拌

蛋白質的機械攪拌或剪切可誘導或加速蛋白質的聚集,因為剪切/攪拌應力提供了誘導構象變化所需的活化能。此外,剪切/攪拌會增加蛋白質表面的疏水性,從而導致蛋白質的聚集。

(4)空氣/水界面

蛋白質分子在開發、生產、運輸和儲存過程中由于機械攪拌和搖晃而暴露于空氣/水界面??諝夂偷鞍踪|疏水區域之間的界面吸附導致蛋白質的構象變化從而聚集??諝?水界面對蛋白聚集的影響取決于蛋白質的分子量以及疏水性。

(5)溫度

分子內氫鍵對球狀蛋白質的結構和穩定性至關重要。熱能會破壞蛋白質的氫鍵,從而導致其展開,最后發生聚集。

圖2 溫度及機械能導致蛋白展開示意圖

(6)蛋白質-賦形劑相互作用

蛋白質-賦形劑的相互作用取決于賦形劑和蛋白質的性質。在上游加工中,糖類、氨基酸和表面活性劑與蛋白質相互作用,從而蛋白質聚集。氨基酸的疏水性和電荷各不相同,會具有不同的聚集傾向。例如,精氨酸可抑制或加速聚集過程,這取決于分子間相互作用的類型。精氨酸與帶負電荷的蛋白質的靜電相互作用導致蛋白質加速聚集,而精氨酸與芳香族殘基的相互作用抑制了蛋白質聚集。


三、下游工藝的影響



下游工藝涉及不同類型的一些相互作用,影響蛋白的穩定性。如在離子交換以及親和層析的實驗中會使用不同pH和離子強度的洗脫緩沖液,同時會存在過濾步驟,上述過程都會改變蛋白質的構象并增加聚集傾向。

(1)蛋白質-表面相互作用

蛋白質-表面相互作用會引起蛋白質二級結構的變化,特別是由于鍵的形成和斷裂而導致螺旋性的喪失。例如,不銹鋼是反應容器常用材料,而不銹鋼微粒會引起蛋白產生一定的聚集。不銹鋼表面不可逆吸附的蛋白質數量促進了聚集過程,吸附蛋白質的量在固液界面處表面誘導的蛋白質聚集中起關鍵作用。同時表面的粗糙程度對蛋白質聚集也有很大的影響。

(2)凍融、凍干及干燥

凍融和凍干通常是下游加工過程中的最后一步,并會誘導蛋白質的聚集。以上過程可能會導致pH值變化,從而導致聚集。此外,蛋白質的干燥也會導致構象變化。


四、其他過程的物理化學因素



其他各種因素,如化學修飾以及儲存也會影響蛋白質的穩定性。例如,脫酰胺化化學修飾會增加蛋白的聚集,由于修飾后蛋白的的疏水性增加,mAb1和mAb2的脫酰胺化增強了其在較低的pH值時的聚集。

總之,蛋白質的天然構象是通過不同的分子內作用力來穩定的,如氫鍵、二硫鍵、靜電、疏水相互作用等,氫鍵對于蛋白質的穩定性是很關鍵的。因此,如果生產及儲存過程中產生的熱、化學和耗散能打破了分子內作用力,就會導致蛋白展開,從而聚集。下表1列出了影響蛋白穩定性的不同因素以及相互作用類型。 



五、如何控制蛋白質聚集? 



(1)蛋白質結構修飾

蛋白質的結構影響著蛋白質的聚集,所以我們放置蛋白質聚集的第一種手段就是對蛋白質的結構進行修飾以及改造。例如我們可以改變蛋白質結合區域的凹面靜電勢,修飾后蛋白間的靜電力減少,這樣就可以有效的防止蛋白質的聚集。

此外我們對于蛋白質的糖基化修飾不完整的糖鏈應特別關注,因為這種情況下很容易導致蛋白質的聚集,在濃縮的過程中更容易產生聚合物。 

(2)生產工藝過程控制

首先在培養基中可以添加CuSO4,這樣可以使游離醇含量降低,從而促進二硫鍵的生成,這樣就減少了以共價鍵形成的蛋白質聚合物。

另外在超濾濃縮前的攪拌等步驟是容易發生聚集的,可以通過使用具有不同結構的超濾膜以及通過添加表面活性劑減少蛋白質聚集的形成。

 在色譜層析過程中,蛋白質的飽和結合導致層析柱表面蛋白質濃度升高,進而產生聚集。一般可以使用精氨酸作為洗脫保護劑而減弱蛋白質的聚集。此外流動相中不同的鹽也會對蛋白質聚集產生不同的影響,所以對于流動相的組成的選擇需要認真研究。

(3)運輸及貯存過程控制

當前有多種具有抑制蛋白質聚集的分子和材料被發現以及應用。以半胱氨酸反應小分子ebselen為例,其能夠有效促進二硫鍵的形成,進而減少蛋白質聚合物的產生。此過程最為關鍵的還是選擇合適的包裝材料。


六、小結



蛋白在制備以及存放過程會有多種因素影響其穩定性,要保證蛋白的療效,那么首先就要確保蛋白的構象沒有改變。而如何降低實驗以及存放過程蛋白構象的改變?那就要了解蛋白在各種因素下,如熱、化學和機械應力、吸附和離子強度下的變化,進而分析蛋白在這些條件下的聚集傾向和聚集機制,以確保其療效和患者的安全性。以下為蛋白生產及存儲過程中小編的幾點建議:

(1)在優化細胞培養的pH、溫度和離子強度時,還應考慮對蛋白質穩定性的影響;

(2)當蛋白反應器械及存儲包材接觸時,應確認表面化學和粗糙度對吸附量和構象變化的影響;

(3)基本了解溫度、pH、鹽濃度、離子強度、剪切對蛋白質穩定性的影響是必要的;認識到這些因素的積極影響和不利影響,將有助于提高穩定性;

(4)目前具有多種表面改性策略,可應適表面改性,提高穩定性;

(5)識別易聚集區域,這樣則可以減少蛋白質聚集傾向,可以使用聚集預測工具來確定易聚集區域。
總之,應系統地探索上游、下游和儲存過程的物理化學因素對治療性蛋白質穩定性的影響,以減輕藥物損失,從而確保療效。


參考文獻
[1]Physicochemical factors of bioprocessing impact the stability of therapeutic proteins.
[2] Poulson B G , Szczepski K , Lachowicz J I , et al. Aggregation of biologically important peptides and proteins: inhibition or acceleration depending on protein and metal ion concentrations[J]. The Royal Society of Chemistry, 2020(1).
[3]付娜, 王捷. 蛋白質聚集的形成與調控機制[J]. 生命的化學, 2007, 27(5):4.


-END-
*聲明:本文由入駐藥融云的相關人員撰寫或轉載,觀點僅代表作者本人,不代表藥融云的立場。
綜合評分:6.4

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